基于mRNA的抗感染性疾病疫苗

摘要

通过体外转录，基于mRNA的传染病疫苗有望成功解决传统疫苗平台的诸多弱点，如疫苗保护缺乏有效性和/或持久性，耗时和生产成本高昂，以及在某些情况下存在安全问题。同时，最近大量振奋人心的数据表明，mRNA疫苗具有的许多属性，正是众多新型人类疫苗所需的。本文简要介绍了mRNA疫苗的类型，讨论了最近发表的关于感染性疾病mRNA疫苗的相关文献，并强调了将这种有前途的新型疫苗模式应用于临床需要克服的困难。

1引言

常规疫苗方法，如减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗，在消灭或控制众多传染性病原体方面发挥了基石作用。尽管进展显著，同时对公共卫生也产生了毫无疑问的积极影响，但目前的疫苗仍面临着几个重大挑战，因为它们在抵御许多重要的人类病原体时，往往不能提供广泛和长期的保护，如：流感病毒、乙型肝炎病毒、结核杆菌和其他病原体，最重要的是，它们不能以足够快的速度应对大流行的威胁。人口密度、旅行习惯、气候变化和抗生素抗药性的增加等方面的根本性变化有利于危险病原体(如蚊子和蜱传播病原体)的出现和迅速传播，并强调了应对全球大流行的必要性，以及在制定预防和治疗干预措施方面的努力。由于疫苗是解决上述问题最简单、最具成本效益的方法之一，因此开发更有效的新一代疫苗，能够迅速用于预防或控制突发事件，是医学研究领域最关键的且未实现的需求之一。

基于RNA治疗的概念于30年前提出，伴随mRNA编码转基因在小鼠体内直接转移，并且随后证明在肌肉中表达而产生。这项研究的开创性发现在接下来的十年中得到证实，证明了注射病毒或癌症抗原编码体外转录(IVT)mRNA可诱发抗原特异性免疫反应。尽管有这些可喜的结果，核酸酶敏感性、不稳定性、体内表达不稳定性以及高炎症反应能力依旧是IVTmRNA主要的缺点，因此，mRNA以最低程度进行着疫苗的开发。

最近的科学和技术进步，例如：加入修饰核苷，从IVTmRNA中去除污染物，优化抗原编码和非翻译区(UTRs)，优化poly(A)尾的长度，开发改进的封盖类似物，以及使用安全、有效的mRNA传递材料，解决了上述大多数问题，并使基于mRNA的疫苗迅速进入多个临床前研究和临床试验。重要的是，概念验证研究表明，基于mRNA的疫苗能够在大、小动物体内诱导针对各种病原体的强有力且广泛的保护性免疫反应，具有可接受的安全性，并且能够快速设计并使用无细胞生产系统进行cGMP制造，使这种技术与传统平台和其他类型的基因疫苗相比更具竞争力。

本文中，我们将简要回顾mRNA疫苗的形成，并为最近针对感染性疾病的疫苗研究提供详细的概述。在整篇文章中，我们强调这些临床前研究如何有助于疾病的预防或治疗，并从未来的角度来审视这一充满希望的技术。

2mRNA疫苗的形成和递送材料

2.1mRNA制备的优化

mRNA疫苗的开发是一个相当简单的过程，首先要确定目标抗原，然后进行优化的抗原编码序列的电子设计，基因合成，并将抗原克隆到一个优化的mRNA产生质粒中。用聚合酶链式反应(PCR)扩增感兴趣的基因时，不需要进行基因合成和克隆。在大多数情况下，Sp6或T7RNA聚合酶被用于IVT，因此Sp6或T7启动子应该被整合到mRNA产生质粒或PCR产物中。mRNA产生质粒经限制性内切酶线性化后，经纯化，加入四种用于构建mRNA的核苷以及RNA聚合酶进行IVT。在mRNA中添加5‘帽子结构是关键的，最终mRNA产物的严格纯化（去除双链RNA和其他无用产物）也包括在制备过程中。最后，优化后的mRNA被制成一种稳定、无毒、可生物降解的药物产品，保护mRNA不被降解。

基于RNA的疫苗比传统的疫苗平台拥有几个优势。除了安全性和效力（表1），最重要的好处之一是mRNA疫苗设计和生产的巨大灵活性。抗原编码序列(开放阅读框架，ORF)可以在特定的位置快速修改和/或密码子优化，以改进翻译或以工程学方法将抗原引导到所需的区域(如可溶性抗原和跨膜抗原形式)，和/或设计用于改进抗原提呈。点突变、缺失或去除假定的糖基化位点等修饰都可能影响抗原性、免疫原性和疫苗效力。通过反向疫苗学设计改进mRNA免疫原性，可以很容易地设计和生产。添加外源序列(例如铁蛋白域)，允许将mRNA编码的抗原(或嵌合抗原)组装成病毒样颗粒(VLPs)或纳米颗粒，可能提高免疫原性，并激发强有力的免疫反应。虽然这种策略还没有被广泛应用于mRNA疫苗，但是它有可能显著的提升疫苗，特别是在B细胞反应方面。除了编码序列上的这些修饰，mRNA的半衰期、蛋白表达的药代动力学(包括幅度和持续时间)和免疫原性都可以通过对5′和3′UTRs的修饰、poly(A)尾部长度的优化、修饰核苷的结合、各种封盖策略的使用以及IVTmRNA的纯化进行微调。

2.2mRNA疫苗类型

mRNA疫苗可以分为非复制型和自我扩增型mRNA(SAM)结构，这些平台的优缺点已经在最近的一些出版物中进行了广泛的讨论，在本文中不会详细回顾。这两种疫苗类型已经在各种临床前模型中成功地用于治疗传染性疾病，而且一些非复制型mRNA疫苗已发表临床数据。关于最近研究的综述在下部分呈现。

疫苗通常通过肌肉内（IM）、皮下（SC）或皮内（ID）方式免疫来有效靶向抗原提呈细胞。由于胞外RNA酶在皮肤和肌肉组织都存在，通过封装或其他方式保护编码抗原IVTmRNA避免快速降解是关键的。除了有限数量的研究使用裸mRNA进行体内传递或各种机械方法，如电穿孔或基因枪，大多数mRNA疫苗研究使用载体材料来保护mRNA免受体内快速降解，将mRNA传递到细胞质，甚至驱动强有力的保护性免疫反应来抵抗病原体。

2.3mRNA疫苗递送材料

mRNA递送材料已经详细讨论，因此，在这篇综述中，我们简要地总结了开发高效安全的递送系统的一般要求，并简明地描述了用于感染性疾病mRNA疫苗的形式。

mRNA疫苗的临床转化依赖于我们克服技术难题的能力，这些技术难题涉及到运载系统的开发，这些运载系统能够在没有明显毒性的情况下，以高效率的方式将货物封装、保护并运送到其作用位置。其他需要在人体试验中进行可行转化的重要特征包括：快速的组织清除、潜在的佐剂活性、靶向传递至关键组织和细胞(即脾脏、淋巴结或抗原呈递细胞)、胶体稳定性，以及制备过程的开发确保mRNA药物产品可扩展性、稳定性和低成本。

阳离子多肽，鱼精蛋白，因其高阳离子密度已经被用来凝聚mRNA，在激活MyD88通路后在动物体内可诱导保护性免疫。然而，mRNA-鱼精蛋白粒子表现出有限的蛋白表达水平，可能是由于两种多电解质之间的强结合亲和性。这个问题随后通过RNActive疫苗平台开发解决，该平台利用非编码RNA-鱼精蛋白佐剂颗粒(2:1质量比)和未复合、未修饰(缺少修饰核苷)序列优化的疫苗抗原编码mRNA一同供给实现。RNActive疫苗在临床前模型中诱导针对各种流感病毒株和狂犬病毒致命伤害的保护性免疫。重要的是，RNActive狂犬疫苗在进行I期临床试验评估。该疫苗在无针臂接种研究中(使用疫苗递送注射器)提供了短期抗原特异性抗体反应，令人惊讶的是，用注射器注射后检测无效果。

聚合物(非脂基)作为核酸传递系统已被广泛研究，并取得了很大进展，但由于潜在的毒性、胶体不稳定性、相对较差的转染效率和高聚合分散性(粒子大小范围广)，使其临床应用仍不确定。Chahal和其同事用化学方法合成了一种改良的树枝状分子，并用一种脂质锚定的聚乙二醇(PEG)和一种抗原编码的自我扩增mRNA，通过一种微流体设备对其进行修饰。修饰的树枝状聚合物形成了单分散纳米粒子(MDNP)，并在接受单剂量肌肉注射的小鼠体内，引发了抗原特异性CD8+T细胞和针对几种病原体的中和抗体反应(寨卡病毒、埃博拉病毒、流感病毒和弓形虫)。复合几个自我扩增的mRNA编码抗原对小鼠具有保护作用，强调了生产多价疫苗抵抗不同病原体的可能性。聚乙烯亚胺(PEI)是一种阳离子聚合物，可以合成线性或分支结构，其分子量(链长)、支化度或电荷密度可以简单精密调节。PEIs结合核酸具有高亲和力，并被赋予逃脱核内体的能力，好像质子海绵效应方式。线性PEIs已经证明，与其支化的同类药物相比，体外毒性降低，体内耐受性改善。线性PEIs，无论是否经过修饰，已被用于开发基于RNA的流感病毒和艾滋病毒临床前疫苗。

含有可离子化脂质的脂质纳米粒(LNPs)是最先进的核酸载体，能够在体内有效地递送mRNA。为mRNA传递和疫苗应用开发LNP系统利用了siRNA临床应用非病毒递送系统开发中获得的大量临床前和临床知识。LNPs已经被广泛用于传递抗感染性病原体的传统和自我扩增的mRNA。这些临床前和临床研究的效果将在以下部分详细讨论。

LNP通常由离子化阳离子脂质(如KC2、MC3和C12-)、两性离子脂质(即二油酰基磷脂酰乙醇胺或DOPE)、胆固醇和脂质锚定PEG以精确摩尔比组成(图1)。阳离子/离子化头部基团和带负电荷的mRNA之间的静电相互作用产生片层结构，表现为带正电荷的脂质双分子层被带负电荷的核酸片层分开。可离子化的脂质已经被合理地设计来提高LNPs的效力和耐受性。另一方面，两性离子脂质被加入到LNPs中，调节囊泡的流动性，改善与膜磷脂的离子配对，促进作用位点的内部释放。包含胆固醇可以提高LNP产品的质量属性(即延长货架期)，通过增加纳米颗粒膜的结构(物理)支持减少体内循环中的自发解离，并通过热力学优势的纳米颗粒-质膜重排改善内涵体释放。聚乙二醇锚定的脂质以低摩尔比(1-2%)制成，以改善胶体稳定性，减少蛋白质的表面吸附，略延长循环半衰期(约10-15min)，并改善表面水合作用。

LNPs进入细胞通过2各阶段，包括通过网格蛋白介导的内吞作用进行快速内化，然后是巨噬细胞作用。在这两种情况下，LNPs通过内涵体途径以及一小部分装载物(1-2%)在内涵体膜破坏后进入细胞溶胶，而剩余的LNPs在溶酶体内降解或进行胞吐作用。LNPs逃离内涵体的确切机制尚不清楚，而且似乎与质子海绵效应关系不大，更多地依赖于多种因素，包括与内溶酶体膜融合后的泄漏。来自MaugEri及其同事的一项最新研究表明，mRNA-LNPs的胞吐作用是通过源自内涵体(内源性内吞囊泡，外泌体)的细胞外囊泡发生的。内源性内吞囊泡在小鼠体内具有生物活性，其生物分布特征与LNPs相似，这表明部分体内mRNA递送（治疗效果）可以通过这种内源性内吞囊泡实现。

虽然LNPs是很有前途的递送系统，但是安全性问题需要考虑，这样才能使LNP形式mRNA疫苗在临床上得到适当的开发。LNPs’的潜在毒性可能是复杂的，由于固有免疫的激活(诱导促炎症细胞因子产生)，可能呈现系统效应，由于脂质在组织内积累，可能产生局部、细胞毒性。毒性可以通过注射预防性、抗炎类固醇或其他分子和/或使用可生物降解的脂质来消除或减少。LNPs也可以激活补体系统，并可能诱发过敏反应，称为补体激活相关变态反应（CARPA），这可以通过不同的方法来缓解，如类固醇和抗过敏前药物(即，地塞米松，对乙酰氨基酚以及抗组胺药物)或在静脉注射过程中使用低输注率。或者，使用LNPs与调节性细胞因子(即IL-10)共同递送可能是减少潜在LNPs相关不良事件的可行策略。

图1细胞对mRNA-LNPs摄入和内吞途径，以及mRNA在细胞质中的释放。

mRNA-LNPs通过内吞作用(即网格蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白介导的内吞作用和大胞吞作用)和内涵体网络以及内源性内吞囊泡(外体或细胞外囊泡)的形式进入细胞。一小部分mRNAs从早期内涵体逃离进入细胞质，在那里它们被转化成蛋白质，可以定向到各种细胞内或细胞外区室(即胞质溶胶、细胞外液或质膜)。模式识别受体(PRRs)检测未修饰的mRNAs(非复制型或SAM)。PRR激活诱导前炎症细胞因子(如I型干扰素)的分泌，从而降低mRNA的蛋白表达和分泌(红色箭头通路)。绿色圆圈代表可离子化的脂质，而红色圆圈代表用于制备脂质纳米粒的两性离子脂质(即DOPE)。大胞吞泡中的浅蓝色圆圈是早期和晚期的内涵体以内吞的脂质纳米粒为代表，而出现在细胞外的橙色圆圈代表内生形成的胞外囊泡（EndoEVs），包含来自内吞LNPs的IVTmRNA和可离子化的脂质。mRNA：信使核糖核酸，CARPA：补体激活相关变态反应，EE：早期内涵体，modmRNA：修饰mRNA核苷，MHC：主要组织相容性复合物，LNP：脂质纳米粒，PEG：聚乙二醇，M：大胞饮作用，ncE：非典型内吞作用(不包括CME，不包括CVE)，CME：网格蛋白介导的内吞作用，CVE：小窝蛋白介导的内吞作用，EV：内吞囊泡或外泌体，ERC：内涵体循环复合物，ECM：胞外基质，PRR：模式识别受体，IVT：体外转录，SAM：自我扩增mRNA，nsp：非结构蛋白。

已发表的关于mRNA-LNP疫苗安全性的临床数据很少，与siRNA无法比较，而且仅限于局部使用(ID和IM)。一种针对H10N8流感病毒的核苷修饰mRNA-LNP疫苗可诱导免疫反应(%血清转换)，大多数患者(20/23)单剂量肌肉接种ug疫苗后，表现出轻微至中等程度的致病性，而在3名患者(3/23)中观察到强烈的局部致病性和全身性副作用。二次ug疫苗接种诱导了较高的副作用发生率。由于担心3级事件发生率较高，最高的疫苗剂量(ug)只接种过一次。与人类的研究结果一致，Hasset及其同事在临床前研究中证明，注射部位以及脾脏和肝脏等器官中长期存在MC3（临床研究中使用的离子化脂质），与毒性增加有关。具有乙醇胺头基团和含酯类脂质尾(可生物降解的)的可离子化脂质被合成作为MC3基础LNPs的替代品，以实现快速的体内代谢(减少毒性)。尽管在一些非人灵长类动物接受多mRNA编码抗流感和寨卡病毒抗原肌肉注射后，系统性检测到IL-6，这种新型LNPs依旧显示出更强的耐受性。这些令人鼓舞的临床和临床前数据警示了是否局部细胞毒性和/或CARPA参与了观察到的不良事件的研究，并强调了需要在毒理学研究中进一步研究LNPs，阐明毒性诱导机制，并开发新的LNP材料用于mRNA疫苗递送。

3感染性疾病mRNA疫苗的临床前和临床应用

感染性疾病mRNA疫苗的文献迅速增多。多项临床前研究已经证明，这种相对较新的疫苗类型能够诱导免疫系统对病毒、细菌和寄生性病原体产生保护性免疫反应。重要的是，临床前的比较研究表明，一些mRNA疫苗优于传统的减毒活/灭活病原体和含佐剂的蛋白亚单位疫苗，进一步证明了这种疫苗类型的前景。虽然一些临床试验正在进行或者最近已经结束，但迄今为止只有有限数量的临床数据被公布。在这一部分，我们将回顾传染病mRNA疫苗领域的现状，并结合上述结果，简要讨论针对各种病原体的保护性疫苗的潜在需求以及如何使mRNA疫苗满足这些需求。由于近期已发表一篇该领域源头性回顾论文，我们的目标主要集中在未在别处讨论过的新的研究方面。

3.1流感病毒mRNA疫苗

流感病毒感染每年导致严重的发病率和死亡率。目前，现有的流感疫苗对季节性流行毒株具有不同程度(约10%-60%)的保护作用，由于病毒的抗原漂移和转变，需要每年重新制备。生产目前使用的疫苗类型需要鸡胚或细胞培养系统，这些系统都有明显的局限性和缺点，例如病毒发展的适应于鸡胚的突变会降低疫苗的效力，难以进行蛋白纯化，以及